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L'impazienza per il rinnovamento, innescata prepotentemente dagli affreschi del Signorelli, si manifestò in alcuni episodi nella prima metà del Cinquecento ed esplose apertamente nella seconda, caratterizzando una terza fase nella storia del monumento che si prolungò in forme più blande nei due secoli successivi.
Già prima di lasciare Orvieto, Michele Sanmicheli aveva progettato e iniziato a scolpire l'Altare dei Magi - commissionato dai Monaldeschi col monumento funerario a fianco realizzato poi da Simone Mosca e Raffaello da Montelupo (1538-1546) e una sepoltura per i conti di Marsciano nella Cappella del Corporale conclusa anch' essa da Simone Mosca (1545); lo stesso Mosca, col figlio Francesco detto il Moschino, realizza l'altare della Visitazione, disposto nel transetto simmetricamente rispetto al precedente.
Antonio da Sangallo il Giovane si occupa del trasferimento del coro ligneo dalla navata centrale, ripavimentata per l'occasione (1540-1541), disegnando anche un grande soffitto a cassettoni decorato con gigli farnesiani speculari a quelli del pavimento; il soffitto sangallesco però non fu realizzato.
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